Tämä materiaali on arkistoitu. Sisältöä ei enää päivitetä. Kaikki sisältö ei välttämättä ole saatavilla.

Kantajavektorit


Geenitekniikka hyödyntää luonnon omia geeninsiirtotyökaluja, faageja ja plasmideja. Plasmidit ja faagit suorittavat luonnossa samanlaisia geeninsiirtoja kuin tutkimuksen palveluksessa. Ne ovat myös luonnon tapa huolehtia sukupuolettomien bakteerien ja faagien geneettisestä muuntelusta, kun uusia geenejä siirtyy soluun niiden mukana.



PLASMIDIVEKTORIT


Plasmidien toimintaa on tutkittu jo 1940-luvulta lähtien, jolloin ne ensimmäisinä löydettiin E. coli:lta. Sittemmin plasmideja on löydetty lähes kaikilta bakteerilajeilta ja joiltain eukaryooteilta, esimerkiksi hiivoilta. Plasmidit ovat pieniä rengasmaisia dna-pätkiä (< 10 kb), joihin sisältyy muutamia geenejä. Geenit voivat olla esimerkiksi muita bakteereita tappavia aineita (bakteriosiineja) tuottavia geenejä, ne voivat välittää kykyä hajottaa joitain aineita (esim. antibioottiresistenssi-geenit), tai lisätä bakteerien taudinaiheuttamiskykyä. Kasvibiotekniikassa hyvin paljon käytetty Ti-plasmidi, joka on eristetty maaperässä elävästä Agrobacterium tumefaciens-bakteerista, aiheuttaa syöpäkasvainten muodostumisen ruohovartisten kasvien varsiin.

Plasmidit siirtyvät luonnossa bakteerista toiseen


1) konjugaatiossa, jossa plasmidin sisältävä solu kiinnittyy toiseen bakteeriin ja kasvattaa niiden välille sytoplasmasillan, jota pitkin plasmidin dna siirtyy. Harvinaista luonnossa, tavataan esim. E.coli:lla.

2) transformaatiossa, jossa siirtyy paljasta dna:ta. Luonnossa harvinaista (esim. Bacillus -lajilla), mutta keinotekoisesti voidaan kaikki bakteerilajit saada transformoitumaan ja tätä menetelmää käytetään geenitekniikassa.

Osa plasmideista integroituu osaksi isäntäsolun omaa kromosomia. Näin toimii esimerkiksi edellämainittu Ti-plasmidi. Osa puolestaan esiintyy itsenäisesti replikoivana (kahdentuvana) osana solua. Itsenäisesti replikoivat plasmidit voivat tuottaa itsestään useita kopioita soluun : high copy number - plasmidit (kopioita 50-500 kpl/solu). Tai kopioitua vain muutaman kerran : low copy number - plasmidit (muutama kpl/solu). Kokeen luonteesta riippuu minkä kopioluvun plasmidia käytetään.

Plasmidit eivät ole kovinkaan lajispesifisiä. Useat niistä siirtyvät luonnossa ainakin lähisukuisten bakteerien kesken. Kullakin eliölajilla on omanlaisensa replikaation aloitusalue, nk. ori-alue. Plasmidissa pitää olla lajille omimainen, toimiva ori-alue, jotta se kykenisi replikaatioon. Ori-alue kontrolloi myös plasmidin kopiolukua. Bakteeriplasmidien ori-alueet poikkeavat kuitenkin eukaryoottisolujen ori-alueista, eivätkä toimi niissä luonnostaan.

Rekombinantti-DNA-tekniikoissa käytetään muunneltuja plasmideja. Ne on rakennettu tarkoituksenmukaisiksi lisäämällä tai poistamalla alkuperäisistä plasmideista osia. Plasmidivektoreita on lisäksi kehitetty monia erilaisia tehtäviä varten, ja sopivan vektorin valinta riippuu paljon työn tarkoituksesta. On kuitenkin olemassa joitain yhteisiä piirteitä kaikille geenitekniikassa käytetyille plasmidivektoreille.

Kaikissa plasmidivektoreissa on:


- Replikaation aloitusalue, ori-alue
- Restriktioentsyymin tunnistuskohta, sisältää usein tunnistuskohdan monelle katkaisuentsyymille.
- Selektiogeeni, useimmiten antibioottiresistenssin geeni


KUVA 1: yksinkertainen plasmidivektori


Usein on tarpeellista että plasmidi saadaan replikoitumaan kahdessa eri isännässä, esimerkiksi bakteerissa ja eukaryoottisolussa. Geenitekniikassa käytetään paljon tavallista leipähiivaa, Saccharomyces cerevisiae, joka kuuluu eukaryootteihin. On toimivampaa tehdä alkurekombinantit, selektio ja kloonaus ensin bakteeri-isännällä, ja siirtyä vasta tarpeen vaatiessa käyttämään lopullista isäntälajia. Tällaisia kokeita varten on rakennettu sukkulavektoreita, joissa on ori-alueet kahdelle eri lajille.

Jos halutaan, että siirretty geeni myös toimii isännässä, täytyy plasmidissa olla myös geenitoiminnan säätelyalue, katkaisukohdan molemmin puolin. Tällaiset plasmidivektorit ovat ekspressiovektoreita. Eukaryoottigeenien ilmentäminen bakteereissa on hyvin hankalaa, koska bakteerien lähetti-RNA syntyy sellaisenaan transkription tuloksena. Kun taas eukaryoottien lähetti-RNA käy läpi modifiointivaiheen, jossa siitä poistetaan nk. insertiosekvenssit. Lisäksi translaatiossa valmistuva valkuaisaine saattaa kaivata muitakin eukaryoottisolun välineitä laskostuakseen oikeanlaiseksi, toimivaksi proteiiniksi. Eukaryoottigeenien ekspressiota tutkitaankin lähinnä eukaryootisoluissa. Leipähiiva on tässäkin toimiva koe-eliö.

Bakteerisolut kykenevät ottamaan sisäänsä paljasta dna:ta vain rajallisen määrän, vaikka niitä keinotekoisesti siinä autetaan tekemällä solun pintakalvo hetkeksi dna:ta läpäiseväksi. Geenitekniikan plasmideista on poistettu kaikki ylimääräinen dna ja näin saatu tila täytetään siirrettävällä dna:lla. Käytetyt plasmidit ovat yleensä vain 1.5-3 kb (1500-3000 nukleotidiparia) kooltaan. Transformaatiossa siirtyy korkeintaan noin 10 kb:tä dna:ta. Siten plasmidien mukana voi parhaimmillaan siirtyä vain noin 7-8 kb:tä dna:ta. Suurempien dna-määrien siirtoon ovat sopivampia faageihin perustuvat kantajavektorit.


FAAGIVEKTORIT


Faagit ovat bakteereissa loisivia viruksia, bakteriofaageja. Ne siirtävät dna:nsa solun sisään transduktiossa. Faagi kiinnittyy solun pintaan ja injektoi dna:nsa solun sisään. Se valjastaa solun koneiston oman lisääntymisensä palvelukseen. Kun faagi on tuottanut riittävästi uusia faagigenomeja, se pakkaa ne proteiinikuoren sisään, hajottaa solun, ja vapauttaa samalla uudet faagipartikkelit etsimään uusia infektoitavia soluja.


KUVA 2: Bakteriofaagin elinkierto


Geenitekniikan käyttämät faagivektorit on rakennettu poistaen faagin omia geenejä ja jättäen jäljelle vain tarpeelliset: ori-alue, vaippaproteiinin-valmistusgeeni ja faagivaipppaan-pakkauksen aloituskohta. Tällainen vektori on mm. Escherichia coli:n -faagiin perustuva -faagivektori. Normaali -faagin genomi on noin 50 kb, mutta siitä voidaan poistaa ja korvata vieraalla dna:lla noin 20 kb:n osuus. Faagin pakkauksessa oleellinen asia on, että pakattava dna-määrä on tuo 50 kb:tä.

Vieläkin suurempi siirtokapasiteetti on myöskin -faagiin perustuvalla kosmidivektorilla, joka on plasmidi, mutta sisältää -faagin pakkausalueen, nk. cos-alueen. Sen mukana siirtyy soluun lähes 50 kb:tä vierasta dna:ta. Kosmidifaagivektori lisääntyy solussa, mutta siltä puuttuu kyky tuottaa lisää uusia faageja, eivätkä ne hajota soluja.


KUVA 3: Kosmidivektori


C-dna-kirjastojen luontiin riittää hyvin plasmidivektorit. Mutta kun halutaan luoda esimerkiksi kromosomaalisen dna:n kirjastoja eukaryooteilta, joissa yhden geenin kattama alue, insertiosekvenssejä koodaavine alueineen, saattaa olla hyvinkin pitkä, on siirryttävä käyttämään suuremman kapasiteetin vektoreita. Eukaryoottigenomi on myös niin suuri, että sitä ei voi hallita, jos se on pilkottu 10 kb:n pituisiksi paloiksi. Hiivan nk. keinotekoiset kromosomit voivat ottaa jopa useiden satojen tuhansien nukleotidiparien dna-jaksoja.


GEENITERAPIAVEKTORIT


Geeniterapiassa pyritään kohdekudokseen viemään geeni, joka korvaa puuttuvan tai vaurioituneen geenin, tai tuo mukanaan täysin uuden parantavan ominaisuuden.

Geeniterapiavektorilla tulisi olla seuraavia ominaisuuksia:


- Sen tulisi integroitua kromosomiin kohtaan, jossa se ei haittaa muiden geenien toimintaa
- Vektorin on oltava vaaraton. Se ei saa muuttua patogeeniseksi solun sisällä.
- Potilaiden immuunireaktion ei tulisi herätä vektoria vastaan, ennen kuin geeni ehtii toimia

Käytetyt vektorit perustuvat mm. retroviruksiin ja adenoviruksiin . Retrovirukset ovat vaipallisia RNA-viruksia (esim. Hi-virus) ja adenovirukset vaipattomia DNA-viruksia.

Retrovirusvektorit integroituvat kromosomiin melko pysyvästi, mutta sattumanvaraiseen paikkaan, jossa ne voivat häiritä potilaan toimivia geenejä. Retroviruksin perustuvien vektoreiden huonona puolena on myös, että monet niistä infektoivat vain jakautuvia soluja.

Adenovirukset aiheuttavat vain harvoin vakavia tauteja, joten niihin perustuvat vektorit ovat turvallisia. Puutteena on siirrettyjen geenien huono toimintakyky. Adenovirusvektoreilla on myös suuri geeninsiirtokapasiteetti.

Koska virusperäisten vektoreiden kanssa on geeniterapiassa omat ongelmansa, on pyritty keksimäään myös muunlaisia dna:n kantajasysteemeitä. Näitä ovat mm. liposomin sisällä kuljetettava dna, tai paljaan dna:n siirto. Ne ovat kuitenkin viruksia tehottomampia, vaikkakin turvallisia.

©Internetix / Helena Salo 1997